标签：积累 知识 测序 reads 细胞 10X mRNA 细胞核
之前说，实验室主要使用的是10X的数据，但是我现在对于10X的数据的了解很少。所以，想更进一步的了解一下。从网页上搜集到资源，整理如下。
RNA-seq技术的主要的目标就是（1）定性（2）定量。所以，在某种程度上，就是围绕着两个目标进行的，只不过提出的解决方法会有所不同。
一句话总结：单细胞测序技术与单细胞核测序技术的区别？
简而言之，就是单细胞测序技术存在一些弊端。只能够取样于新鲜组织，而一些临床的冷冻的样本，无法得到利用。在解离的过程中，一些细胞这种应激的条件下，基因的表达发生变化。同时，一些不易解离的细胞类型也会因此被过滤掉，而使我们最终的分析丧失一些重要的信息。
因为这些问题的存在，所以我们现在发明了单细胞核技术。主要的不同点在于，单细胞测的是细胞质+细胞核的遗传信息，而单细胞核如其名，测的是细胞核内的遗传信息。由于细胞核膜相对于细胞膜是更加稳定的，所以在实验的过程中也更加容易操作，从而规避了我们上面提到的一些单细胞测序技术的弊端，临床冷冻的样本的遗传信息也能够得到有效的利用。
那么，这个时候我们可能会问，单细胞核测序技术只是测序了细胞核内的遗传信息，那么，没有得到细胞质内的遗传信息（如部分mRNA,因为我们知道，成熟的mRNA,要在细胞质中进行翻译。）对于整体的影响大吗？从目前的实验结果上看，snRNA-seq的表现与scRNA-seq完全一致，同样能够准确的捕捉到细胞的转录状态，这一点已在不同组织、不同外界处理条件等多种情况下得到了证实。
链接：https://www.bilibili.com/read/cv7136279/
主要的过程:
（1）Gel bead与细胞结合，形成GEMs。
在这个过程中，与细胞结合并标记细胞的Gel bead由四个部分组成。各有其各自的作用。
- R1：为一段已知序列的DNA片段，用于后续的测序。
- 10X Barcode：用于标记细胞。
- UMI：在混合测序的过程中，用于区分不同的cDNA来源的reads。也就是在后续的建库扩增的过程中，cDNA不断的扩增产生reads,来源于同一个转录本的reads的UMI相同。
- poly(dT)VN：通过与mRNA的polyA尾互补配对，捕获细胞中游离的mRNA。
每一个细胞有一个特征的UMI。之后，在进行扩增建库的过程中，只要是由该细胞扩增产生的cDNA,都会带有这段UMI。
（2）建库
通过某种方法，将细胞裂解，释放出mRNA,利用逆转录酶，将mRNA反转成双链cDNA,进行扩增。而Gel bead所起到的作用就是，将我们细胞中的mRNA的序列信息捕获，然后通过反转录的方式，转换为带有特征的细胞标记的reads。
由于这个平台的测序过程是高通量的。所以，将所有的reads（来源于不同的细胞的不同的mRNA）都集中起来进行测序。而后续的过程中，如何将这些不同来源的reads区分开来，就是利用我们的标记。
一般而言，有几个维度的标记：
- 来自哪一个样本（患者，如果是一个个体的某个组织的话，另当别论）
- 来自哪一个细胞（因为我们要在细胞维度上，进行表达量的识别，所以这部分的信息也很重要）
——10X barcode - 来自哪一个基因（通过基因的识别，我们知道是哪些基因的表达）
——UMI
所以，最终表现在counts矩阵上，就是行为所在的细胞，列为基因，值为定量后的表达值。
（3）生物信息学分析
一般而言，会使用Cell Ranger，以及随后使用的seurat包进行数据的处理。
参考链接：https://www.jianshu.com/p/ef88433709bd
特征：
（1）非全长的测序，通过测序3’端，来定量基因的表达。具有较强的3’端偏好性。
（2）测序样本，要求90%以上活细胞。
（3）真正意义上对单个细胞的表达量进行汇总。
（4）通量高，建库周期短。10X Genomics 一次测序可以捕捉100-80,000个细胞，具有极高的细胞通量。单细胞的测序通量平均也在50,000 reads/每一个细胞，而如果使用细胞核进行测序则平均通量为25,000 reads/每一个细胞核。
（5）具有较为严重的drop out问题。
什么是drop out问题？这个问题是单细胞测序技术的普遍的问题，只不过10X的方法得到的结果更为显著。具体表现在，一些基因在一些细胞中根本检测不出表达，在另外一些细胞中则显著高表达（排除生物学因素影响）。
如何理解单细胞测序过程中的覆盖率？
标签：积累,知识,测序,reads,细胞,10X,mRNA,细胞核 来源： https://blog.csdn.net/weixin_40640700/article/details/117222450
本站声明： 1. iCode9 技术分享网（下文简称本站）提供的所有内容，仅供技术学习、探讨和分享； 2. 关于本站的所有留言、评论、转载及引用，纯属内容发起人的个人观点，与本站观点和立场无关； 3. 关于本站的所有言论和文字，纯属内容发起人的个人观点，与本站观点和立场无关； 4. 本站文章均是网友提供，不完全保证技术分享内容的完整性、准确性、时效性、风险性和版权归属；如您发现该文章侵犯了您的权益，可联系我们第一时间进行删除； 5. 本站为非盈利性的个人网站，所有内容不会用来进行牟利，也不会利用任何形式的广告来间接获益，纯粹是为了广大技术爱好者提供技术内容和技术思想的分享性交流网站。