nanopore测序技术专题（六）：测序错误率太高无法使用？
十二年前，你嫌illumina测序错误率高，不愿第一个吃螃蟹；七年前，你嫌pacbio的错误率高，觉得应该在等等；四年前，你担心国产的BGIseq错误率高，不愿尝试；现在你还是害怕nanopore测序错误率高，怕投入失败，决定还是坚守二代，等后面测序质量提高的吧。对不起，“君生我未生，我生君已老”。而且不仅为你写诗，还为你点歌：爱一个测序仪好难……
测序错误太高怎么办
按我对测序仪的评价标准，准确性第一位，测序读长第二位，然后是通量，价格，建库测序简易型。为什么准确性第一位，因为如果碱基准确，会给数据分析带来极大的便利。如果准确性高，也无需进行特别特别高深度测序了，现在数据分析中很多算法都是为了处理错误率的问题，比如利用kmer的方法进行拼，GATK中的BQSR以及VQSR，如果测序准确性高，可以省略掉这些过程，极大的节约时间和成本。然后目前，完美的测序仪是不存在的。按照大家固有的印象，一代准，二代多，三代长。有些人一听到10-15%的错误率就被吓得望而却步，其实不用这样。一个好的科学家能够根据每一种平台数据的特点，有针对性的应用，化腐朽为神奇。而不必一棒子打死一个测序平台。如果基因组能够从头测到尾部，准确性100%，你就可以长期休假了。目前测序市场上有各具特色的测序仪可供选择，其实挺好的。正所谓“一花独放不是春，百花齐放春满园”。
测序为何有错误
前面推文我们介绍过，测序仪其实是通过将化学碱基放大为光信号，溶液PH值变化信号，电信号等来进行识别。然而DNA碱基太小，同时化学结构又相似，因此不容易识别。传统的sanger测序，基于链终止反应。能够让一段长度为N的DNA，最终切割成1-N长度的序列，每个长度带一个荧光基团，然后通过跑胶并识别荧光基团来识别碱基。因为通量低，这种方法比较容易，人为即可识别出碱基，因此，准确性较高，可以答到万分之一的水平。高通量测序时代，由于一次要同时并行处理百万级别以上条数的DNA序列，需要对每一条进行多次PCR扩增，通过同时读取碱基荧光信号，最终对拍摄的照片进行处理。由于测序反应到后期，容易出现某个碱基插队（pre-phasing）或者掉队（phasing）的情况，给荧光信号带来干扰，导致碱基识别的准确性降低，因此，二代测序的准确性较一代偏低，不过依然可以达到千分之一的水平。而pacbio由于采用单分子测序，单个碱基的信号较弱，容易读取错误，不过由于采取滚环多次测序，而且测序错误随机分布，后期可以进行校正，大大提高准确性。
nanopore测序错误来自哪里
前面我们介绍过nanopore测序的原理，主要是利用一个马达蛋白穿过纳米孔，通过记录碱基穿过纳米孔时电流信号的变化来识别碱基。还是同样的道理，碱基电流太微弱，同时化学结构又相似，因此，你要知道这个技术难度很大。而且你要知道更重要的事情是，读取碱基并不是每次读取一个碱基，如果这样的话，最终只有四种电流图，那就容易识别了。像一代测序一样四种峰图，二代测序四种波长光。纳米孔的探测区的长度约4-6个bp，因此实际上记录的是：当时通过该区段的那4-6个碱基片段共同引起的电流信号改变。那么四种碱基，4-6个组合，理论上来说应该有4的4，5，6次方组合，一共5376种组合。这就给碱基识别带来了比较大的困难。碱基识别本质上就是分类器，属于有监督学习，需要开发合适的分类算法来进行识别。因此，我们来看到nanopore经常发布新的碱基识别算法，比如目前使用的基于神经网络算法（RNN）的碱基识别。
（以上说好听起来好像很有道理，其实都是我猜测的，如有雷同，可能我猜对了，哈哈哈……）
那么不能让每次读取的碱基数目相同吗，比如每次刚好4个，1个当然最好了，谁不想呢？但肯定很难做到，因为每秒钟读取碱基数目450bp并不是恒定的，没办法保证每次读取固定数目碱基组合。那么这就会对一种特殊的序列组合产生影响，例如基因组上的同聚物Homopolymer（也叫做均聚物），单一碱基重复的区域（例如AAAAAAAAAA），这样的区域基因组上还不少，读取头无法很好地判断其重复区间的长度。因此目前的纳米空测序这种小的InDel很多。
如何改进
由于纳米孔测序的错误是随机分布的，没有碱基偏好性，因此对于短小变异的检出都推荐增加测序深度来进行判断和纠正。但是目前对于碱基重复的均聚物的读取正确率缺乏好的策略。但是也不是毫无希望，目前主流的R9.4.1版Flowcell中纳米孔含1个读取头，而新研发的R10版Flowcell的纳米孔配有双读取头，探测区更长。有助于解决homopolymer区的错误率问题。
在软件算法方面，采用最新的成为flip-flop的算法。“flip-flop”原本形容穿拖鞋走路时啪嗒啪嗒的声响，这里用来比喻对重复碱基的标记的上下翻转记号。简单说，默认将序列标记为（+），而每遇到相同碱基的时候就翻转一下，给一个（-）的标记，下一个如果还是重复的就再反转回来，标记为（+）。这样在basecalling的最后阶段，根据带（+）（-）标记就能更准确区别出相同碱基的个数，从而提高Homopolymer区读取的正确率。
二代与三代错误率比较
下面我们拿真实的数据，对二代与三代的测序错误率进行比较。同样的样品分别采用illumina测序与MiniION测序，将测序数据分别比对到近源参考序列上，然后可视化数据。通过可视化，可以看每个位点测序的细节。这里面只是拿一个案例来作为演示，不同样品不同数据可能会有所不同，由于nanopore测序更新比较快，后面产出的数据可能会有很大的不同。
下图为illumina测序数据可视化，图中亮点是与参考序列不同的碱基，可能是测序错误，也可能是SNP，此图中的亮点并不多，而且可以通过高深度测序来进行排除。
下图为nanopore测序数据可视化，同理，亮点为错配位点，图中错配亮点较多，而且有很多连续的错配位点。
仔细观察这些亮点，处理错配碱基，很大一部分为空位，这就是小的InDel。
标签：读取,错误率,碱基,测序,nanopore,识别 来源： https://blog.csdn.net/u010608296/article/details/113822547
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